Vô tinh trùng được phát hiện trong quá trình chẩn đoán vô sinh. Cơ sở là đánh giá phân tích tinh dịch hai lần tại hai thời điểm độc lập nhau (mẫu tinh dịch sau khi ly tâm không thấy có tinh trùng dưới kính hiển vi) và một số xét nghiệm nữa.[14]

Điều tra tiền sử, bệnh sử: sức khỏe nói chung, sức khỏe tình dục, khả năng sinh sản trong quá khứ, ham muốn tình dục và hoạt động tình dục. Cần hỏi bệnh nhân liệu đã từng sử dụng liệu pháp y học như hormon/steroid, kháng sinh, thuốc ức chế 5-ASA (sulfasalazine), thuốc chẹn alpha, chất ức chế 5 alpha-reductase, thuốc hóa trị liệu, thuốc trừ sâu, chất kích thức (cần sa, lạm dụng rượu), sự tiếp xúc tinh hoàn với nhiệt độ cao hoặc phẫu thuật can thiệp. Tiền sử gia đình cũng cần được xem xét để tìm kiếm các bất thường di truyền.[3]

Phát hiện sự vắng mặt bẩm sinh của ống dẫn tinh khi khám cơ thể và xác nhận bằng siêu âm qua trực tràng (transrectal ultrasound, TRUS). Siêu âm qua trực tràng có thể đánh giá nguyên nhân vô tinh trùng là do tắc nghẽn, các bất thường liên quan đến tắc nghẽn ống phóng tinh, chẳng hạn như bất thường trong ống dẫn, u tuyến tiền liệt nhằm cắt bỏ.[15] Phân biệt với hiện tượng xuất tinh ngược bằng cách phân tích nước tiểu sau xuất tinh, tìm sự hiện diện của tinh trùng sau khi kiềm hóa và ly tâm.[9]

Nồng độ LH và FSH thấp cùng với nồng độ testosterone thấp hoặc bình thường là dấu hiệu của các vấn đề vô tinh trùng, trong khi nồng độ gonadotropin cao lại cho thấy tinh hoàn có vấn đề. Tuy nhiên, sự phân biệt này không rõ ràng và để phân biệt giữa vô tinh trùng tắc nghẽn và không tắc nghẽn thì cần phải sinh thiết tinh hoàn.[3] Mặt khác, "Ở nam giới vô tinh trùng vẫn có thể tích xuất tinh bình thường, nồng độ huyết thanh FSH lớn gấp hai lần giới hạn trên của phạm vi bình thường là chẩn đoán đáng tin cậy về sinh tinh và khi được phát hiện thì xét nghiệm sinh thiết tinh hoàn chẩn đoán là cần thiết"[14][16][17] Không chỉ vậy, nồng độ hormone FSH cực cao (>45 ID/mL) được chứng minh là dấu hiệu của việc chiết xuất tinh trùng ở tinh hoàn thành công.[18]

Huyết thanh ức chế-B yếu chứng tỏ có sự hiện diện của các tế bào tinh trùng trong tinh hoàn, tăng cơ hội mang thai thành công thông qua thao tác chiết xuất tinh trùng trong tinh hoàn (TESE), có độ nhạy 0,65 (khoảng tin cậy 95% [CI]: 0,56–0,74) và độ đặc hiệu là 0,83 (CI: 0,64–0,93).[19]

Các protein huyết tương TEX101 và ECM1 gần đây đã được đề xuất để chẩn đoán phân biệt các loại vô tinh trùng và dự đoán kết quả TESE.[20][21] Bệnh viện Mount Sinai tại Canada bắt đầu thử nghiệm lâm sàng để kiểm tra giả thuyết này vào năm 2016.[22]

Người ta khuyến cáo rằng suy tuyến yên nguyên phát ở nam giới có thể là do di truyền.[2] Những người đàn ông mắc bệnh vô tinh trùng mà bị suy tinh hoàn được khuyến cáo nên đăng ký xét nghiệm kiểu nhân đồ và xét nghiệm vi mất đoạn nhiễm sắc thể Y (Y-micro-deletion testing).[8][14][23][24]